taqman荧光pcr测定原理中的关键点

提问时间：2024-06-21 13:33:59 | 2人回复

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Taqman 荧光 PCR 测定原理中的关键点包括：荧光染料：Taqman 荧光 PCR 技术使用荧光染料，如 FAM、VIC、NED 等，这些染料可以与特定的寡核苷酸探针结合，在 PCR 反应过程中产生荧光信号。

寡核苷酸探针：Taqman 荧光 PCR 技术使用寡核苷酸探针，这些探针通常设计为与目标 DNA 序列特异性结合。探针的 5'端和 3'端分别标记有荧光染料和淬灭染料。荧光信号产生：在 PCR 反应过程中，Taq 酶沿着模板 DNA 链合成新的 DNA 链。当 Taq 酶遇到寡核苷酸探针时，它会切割探针，释放出荧光染料，产生荧光信号。荧光信号检测：荧光信号可以通过荧光检测仪或实时 PCR 仪进行检测。荧光检测仪可以实时监测荧光信号的强度，并将其转化为 PCR 产物的量。定量分析：通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定目标 DNA 序列的量。标准曲线是通过对已知浓度的标准 DNA 进行 Taqman 荧光 PCR 反应获得的。特异性：Taqman 荧光 PCR 技术的特异性取决于寡核苷酸探针的设计。探针必须与目标 DNA 序列高度特异性结合，以避免非特异性扩增和假阳性结果。灵敏度：Taqman 荧光 PCR 技术的灵敏度取决于荧光染料和寡核苷酸探针的浓度、PCR 反应条件和仪器的灵敏度。通过优化这些因素，可以提高 Taqman 荧光 PCR 技术的灵敏度。总之，Taqman 荧光 PCR 测定原理中的关键点包括荧光染料、寡核苷酸探针、荧光信号产生、荧光信号检测、定量分析、特异性和灵敏度。这些关键点的优化和控制对于获得准确和可靠的结果至关重要。

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荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。